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第三 单基因遗传病及相关检测技术 01（第2页）

二、经典单基因病检测技术

目前已被美国国家生物技术信息中心（NCBI）正式收录的相关基因有23000多种，分子机制明确的有4500多种，包括常染色显性、隐性及X连锁遗传病。

单基因病虽然发病率低，但是种类多，所以合并数量众多，对患者家庭乃至社会造成沉重负担。

临**迫切需要对这一类患者及家庭提供有效的检测及咨询，对婚育进行指导，避免遗传病的再发。

随着遗传学和分子生物学技术的发展，越来越多的疾病基因或候选基因被识别，基因突变与疾病的关系也逐渐明确。

基因诊断已经逐步应用于临床。

目前用于检测基因突变的方法很多，如Sanger测序、MLPA、实时荧光定量PGS）等。

（一）Sanger测序

Sanger测序也称为双脱氧测序或链终止反应。

它是基于添加双脱氧核苷酸（ddNTPs），通过DNA聚合酶，用于扩增反应。

不同颜色荧光团标记ddNTPs使自动化DNA测序成为可能。

在这种技术中，经过一系列的扩增后，片段被分离纯化以去除未结合的游离荧光成分，然后通过毛细管分离电泳。

最后将结果与数据库中参考序列进行比较。

Sanger测序是被广泛用作分子诊断的金标准，也用作高通量测序结果的验证。

它可以检测序列上的点突变和微小插入缺失变异，并且需谨慎解释其测序检出的结果。

在隐性遗传的疾病中，由于可能影响基因诊断（尤其是遗传咨询和产前检查诊断）的结论，所以需家系验证其两种致病性突变是否位于不同的等位基因（反式）。

如果两种突变都存在于同一等位基因（顺式）中，受检者还有另一个未知的突变没有检测到，一般用其父母双方的DNA进行测序分析。

此外，在对意义未明的变异进行诊断报告前，其对剪接或蛋白质活性或定位可能的影响需要进行计算机预测分析，选择性剪接位点可以通过RNA水平的A测序进行验证。

（二）多重连接探针扩增技术（MLPA）

MLPA是一种高通量探针连接后的PCR扩增技术，这些方法是基于将不同长度的探针与目标序列杂交，然后通过连接酶将杂交后的引物连接并进行PCR扩增，随后通过毛细管电泳分离扩增片段，并通过分析受检者样品和对照样品之间峰值信号的高低进行运算，获得待检测片段的拷贝数。

MLPA能够检测异常拷贝数变异，如基因组序列中缺失和重复片段。

逆转录MLPA（RT-MLPA）和甲基化特异性MLPA（MS-MLPA）是该技术的另外应用方向，用于mRNA表达水平和甲基化水平的分析。

MLPA检测的一个重要的局限性，在于遗传变异对探针杂交效率的影响。

探针与目标序列的不匹配，可能导致探针信号的降低或丢失，进而错误地判断其片段缺失。

因此，有必要使用另一种方法或使用一组不同的探针进行结果确认，尤其是缺失片段中只涉及一个探针时。

建议对探针覆盖的外显子进行序列分析，确定患者在该区域存在的未知致病性基因变异。

（三）实时荧光定量PCR（RealtimePCR）

实时荧光定量PCR基于PCR扩增的同时对荧光标记靶序列进行检测或定量。

其主要应用于4SNP基因分型、拷贝数变异（V）分析和基因表达等。

荧光标记有两种主要策略：双链DNA（dsDNA）结合染料和荧光标记引物或探针，其中最常使用的双链DNA染料为SYBRgreen。

它非特异性地与双链DNA结合并发出比染料在溶液中游离时强得多的荧光信号。

其设计分析相对简单，并且具有较低的经济成本。