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第三 单基因遗传病及相关检测技术 01（第3页）

此外，它还可用于分析溶解曲线、荧光图强度与温度的关系，并检查扩增子的特异性。

然而，由于它所使用的荧光是单个通道发出的，因此仅限于分辨单个扩增反应，其非特异扩增和引物的扩增二聚体也会影响其定量分析。

关于标记探针检测，应用最广泛的属于Taqman探针。

由于探针是由5’端的荧光报告染料和3’端的猝灭染料组成，具有特异性的靶向寡核苷酸。

未扩增前的探针，其报告荧光基团因其接近猝灭剂而发生猝灭。

在扩增过程中，探针与DNA杂交并被聚合酶的5’和3’端核酸外切酶活性切割，荧光基团释放，并随着扩增片段数量的增加，其释放的报告基团和荧光信号成比例增加。

虽然Taqman探针比双链DNA染料更加昂贵，但可以提高检测通量、降低成本，并缩短多重反应的检测分析时间，而且它对低拷贝数的目标序列检测也更加敏感。

（四）高通量测序（NGS）

在过去的40多年中，Sanger测序，无论是凝胶测序还是毛细管测序电泳，都被认定为分子诊断中鉴定目标序列变异的金标准。

然而，这种通过外显子测序来分析单个基因和外显子的传统分析方法，已经逐渐被更具成本效益和时间效益的替代方案超越。

高通量测序技术，也称为二代测序，允许在短时间内对基因组区域进行测序而且成本相对较低。

当前存在着不同原理的平台，使用不同的化学反应，可以对数以百万计的DNA小片段进行并行测序。

其中应用最广泛的包括：罗氏454平台使用的焦磷酸测序法；Solexa平台的边合成边测序法（现Illumina）；基于离子pH改变的半导体测序技术（ThermoStific）；华大平台的边连接边测序法。

这些方法尽管有其内在差异，但都依赖于由短DNA片段组成的DNA文库进行测序，然后根据参考基因组序列进行排序和组装，因此生物信息学成为数据分析中非常重要的一部分。

NGS的应用包括对PCR扩增的基因组区域进行测序、全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）。

其中对于产前运用全外显子组测序的解读还有很多问题需要解决，其中包括检出大量的临床意义未明的变异。

当向患者报告临床意义未明的变异时，可能会引起他们严重的焦虑，并使临床决策具有很高的挑战性。

不同的产前诊断中心依赖于自身的实验室报告，这些报告可能具有较大的室间差异。

并且报告依赖于实验室人员单个的文献搜索，这可能导致分析流程烦琐，耗时且范围有限。

鉴于未来越来越多的家庭要求采用WESWGS对胎儿先天性异常进行基因诊断，并且大多数与特定胎儿表型相关的系统分类变异基因都很少，因此有迫切的科学研究需求，需要对产前胎儿基因组的相关基因和变异进行校正。

虽然WGS当前不是常规临床诊断的一部分，但在研究复杂疑难疾病中的病因中体现出巨大的价值。

另外，WGS由于其成本的不断降低，已成为许多地方的常规诊断程序，未来可能成为分子诊断的首选。

伦理方面与偶然发现的变异披露有关（即发现致病性），然而与目标表型无关联的基因致病性突变是WES检测报告的主要挑战之一。

NGS在人类遗传性疾病的分子诊断方面具有广泛的临床应用价值，包括单基因疾病、多基因疾病、基因组疾病等。

例如靶向测序，其主要优点是可以在疑似某种疾病的条件下，同时分析导致其表型的众多基因。

对于WES而言，可以在没有明确临床诊断的情况下，对所有基因的外显子进行筛查并确定其遗传诊断。

连同WGS方法，这些技术正在协助我们对罕见的孟德尔疾病进行致病突变的鉴定，并扩大这类罕见综合征型疾病的表型谱。

三、单基因病与胎儿发育异常

（一）地中海贫血

地中海贫血简称地贫，为一组常染色体隐性遗传性溶血性疾病，是全球广为流行的常见遗传性疾病，我国以南方为高发区，尤以广西、广东两省较为严重。

地中海贫血以α或者β珠蛋白链合成障碍为特征，其中最为常见的是α地贫与β地贫。

其中α地中海贫血（αthalassemia）有两种临床类型：血红蛋白Bart’s水肿胎儿（Hb-Bart’s）综合征和血红蛋白H（HbH）病。

前者由于缺失所有的4个α珠蛋白基因，后者最常见的原因是3个α珠蛋白基因缺失或点突变。